病毒感染可视化以及药物筛选评价体系的构建

在新冠病毒疫情阴霾笼罩下的这大半年，大家心里可能对病毒这个词都有些敏感和畏惧。从生物学角度来说，病毒的确可怕，但其实又没有那么恐怖。我们害怕是因为我们不了解它，但研究者们在用各种各样的方法来帮助我们揭开病毒的面纱。

人巨细胞病毒（HCMV）可引起多种器官系统和组织类型的疾病。临床分离的病毒能够进入多种多样的细胞类型并开始复制，包括上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和单核细胞来源的巨噬细胞等。

目前大部分关于HCMV入侵途径的研究所采用的病毒株都是基于成纤维细胞易感性的，比如AD，因为该病毒株扩增速度快，同时在体外培养过程中能够获得更高的滴度。但有越来越多的研究表明，HCMV进入成纤维细胞和其他生理相关细胞类型的途径是不同的。因此，要获得一个更加具有临床指导意义的完整有效的HCMV抗病毒疗法，需要对于HCMV入侵其他细胞类型的途径和机制进行更加深入的研究。

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怀念美好旧时光

病毒改造后验证

作者首先构建了一个HCMV报告株（AD-pp65GFP），在AD病毒的基础上，将GFP插入到UL83基因的C端，UL83基因负责编码pp65蛋白，该蛋白是HCMV病毒粒子中最丰富的蛋白，且在病毒入侵宿主细胞后立即靶向细胞核富集，通过融合表达的绿色荧光蛋白GFP，从而实现病毒附着和入侵过程的可视化。同时作者对插入GFP后的报告病毒株AD-pp65GFP进行了生长动力学的检测，发现该病毒株与野生型大致相同。

图1.AD-pp65GFP报告病毒株感染人皮肤成纤维细胞后在不同时间点成像结果

另外，为了使得AD-pp65GFP病毒株能够感染表皮和内皮细胞，作者通过同源重组的方式同时对该病毒株的UL基因位点进行了修复改造，使其基因序列与临床分离的病毒序列相同（VR），使得最终获得的AD-pp65GFPrUL报告病毒株能够表达完整功能的五聚体糖蛋白gH复合物，从而满足对表皮和内皮细胞的感染性。为了验证UL基因是否被正确重组，作者首先分别用AD-pp65GFP和AD-pp65GFPrUL病毒感染上皮细胞，3天后，可以明显观察到ADrUL感染组有大量的绿色荧光蛋白的产生并且能够观察到细胞病变效应。

图2.上皮细胞ARPE-19在被AD-pp65GFP病毒（左图）以及ADrUL病毒（右图）感染3天后成像结果

接着，为了定量检测ADrUL对细胞易感性的恢复，作者比较了上皮细胞(ARPE-19)、内皮细胞(HUVEC)以及成纤维细胞(NHDF)分别在两种病毒不同浓度下的感染情况。结果表明，AD-pp65GFP的增加导致了MOI依赖性的成纤维细胞感染数量的增加，但上皮细胞和内皮细胞感染则相对较少；而ADrUL报告病毒株则以MOI依赖的方式感染所有测试的细胞类型。至此，作者完成了对病毒的改造以及验证工作。

图3.用AD-pp65GFP病毒(左图)以及AD-rUL病毒(右图)以不同的剂量分别感染ARPE-19、HUVEC以及NHDF细胞后的细胞感染率

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怀念美好旧时光

探索不同药物对病毒入侵方式的影响并构建筛选评价体系

为了构建后续大规模化合物库的筛选分析方法，作者首先选取了两种已知功能的化合物作为研究对象。其中肝素（Heparin）是与HCMV膜蛋白结合，从而抑制病毒吸附于宿主细胞表面，而硫脲（Thiourea）则抑制病毒内在化过程。分别用肝素和硫脲处理NHDF细胞以及ARPE-19细胞，发现两种药物处理后的细胞表型有很大的不同。在未处理的细胞中，细胞核内有大量的GFP积累；硫脲处理组的细胞表面可见绿色荧光颗粒，表明附着后抑制；而肝素处理组不论细胞核还是细胞表面都没有可见的绿色荧光，除了少数病毒聚集，表明抑制了病毒的附着。

在用Cytiva的INCellAnalyzer高内涵成像分析系统捕捉到这些药物处理后所发生的细胞表型变化的差异后，作者接着使用INCellAnalyzer配套分析软件中的颗粒模块（granularitymodule）对图像进行分析，量化表型的差异，同时可以将病毒聚集物排除在分析之外，从而得到更加精准的结果。因此，作者为后续大规模的筛选建立起了区分两种抑制病毒进入方式的分析方法。

图4.成纤维细胞(NHDF)和上皮细胞(ARPE-19)分别经DMSO、硫脲化合物或肝素处理后呈现出的不同细胞表型以及量化结果

在构建好整个筛选评价体系之后，作者对包含有个小分子药物的化合物库进行了大规模筛选实验。面对如此庞大的化合物库以及多种多样的实验组设置，要想提高实验效率则必须得有一个快速高通量的同时兼顾了成像和分析的工具。在该实验中作者采用的是Cytiva的INCellAnalyzer高内涵成像分析系统，这种基于图像的分析，不仅能够帮助研究者非常直观的看到病毒的入侵过程，而且也是评估药物对细胞毒性方面非常有利的工具！

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参考文献：

High-contentscreeningtodistinguishbetweenattachmentandpost-attachmentstepsofhumancytomegalovirusentryintofibroblastsandepithelialcells.YvonneIbig-Rehm.et.al.AntiviralResearch